Mã hoàng hậu vốn là cháu xa đời của tướng Triệu Xa của nước Triệu thời Chiến Quốc. Do Triệu Xa có công, được Triệu Hiếu Thành vương phong làm "Mã Phục quân", từ đó con cháu lấy Mã làm họ[2]. Thời Hán Vũ Đế, nhà họ Mã dời từ Hàm Đan đến Phù Phong, Mậu Lăng (nay là Hưng Bình, Thiểm Tây). Cuối thời nhà Tân, cha bà là Mã Viện từng được tiến cử làm chức Đại doãn ở Tân Thành. Nhà Tân mất, Mã Viện sang Lũng Tây theo Quỳ Ngao; sau đó theo Hán Quang Vũ Đế bình định Lũng Tây và Mã Viện được phong làm Thái thú Lũng Tây, lại phong "Tân Tức hầu" (新息侯).

Tại đây, Mã Viện sinh liên tiếp 3 người con gái, trong đó Mã hậu là con gái út, bà được sinh ra vào khoảng năm đầu Kiến Vũ đời Hán Quang Vũ Đế. Từ bé, Mã hậu thường sống với bà ngoại, mẹ và các anh chị, do cha thường đi chinh chiến xa nhà, tỏ ra là người chăm chỉ, tự rèn luyện tâm tính[3].

Năm Kiến Vũ thứ 25 (49), nhà họ Mã xảy ra biến cố. Mã Viện qua đời khi đi dẹp quân phản loạn ở Vũ Lăng (thuộc tỉnh Hồ Bắc hiện nay). Những người không cùng cánh cùng tố cáo Mã Viện, nên nhà họ Mã bị thu hồi ấn Hầu tước. Không lâu sau, anh Mã thị đang làm Khách khanh cũng qua đời, rồi mẹ bà Lận phu nhân vì suy sụp nên ngã bệnh. Giữa hoàn cảnh đó, Mã thị mới 10 tuổi đã phải gánh toàn bộ công việc nhà, tuy còn nhỏ nhưng tài quản lý của Mã thị khiến kẻ dưới đều phục. Những người xung quanh đều rất khâm phục cô bé họ Mã[4][5].

Nghe đến tình trạng này của gia đình họ Mã, không ít người liền tỏ ra khinh thường. Lúc Mã thị đương bệnh, mẹ bà Lận phu nhân đã từng nhờ người xem dùm, người ấy nói:“Cô bé này tuy rằng là có bộ dáng bệnh tật, nhưng là chắc chắn đại quý, nhưng vạn lần không thể nói ra”. Sau đó, Lận phu nhân tiếp tục mời thêm thầy biết xem tướng số đến, người này nói:"Người này có tướng đại quý, tuy nhiên đường nối dõi hạn hẹp, nếu biết nuôi dưỡng dạy dỗ con người khác tốt, ngược lại càng được hơn là chính mình sinh ra!"[6].